NRAMP 1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-421957-ACT

Slc11a1 codifica o NRAMP1, um transportador de membrana fagossomal que regula o fluxo de íons metálicos divalentes, incluindo ferro e manganês, em macrófagos e outras células mieloides. Ao modular a disponibilidade de metais e as condições do fagolisossomo, o NRAMP1 influencia funções efetoras antimicrobianas, o manejo do estresse oxidativo e programas subsequentes de sinalização imune inata que coordenam respostas inflamatórias. Em modelos murinos, variações em Slc11a1 têm sido associadas a alterações na suscetibilidade a patógenos intracelulares e a patologia mediada pelo sistema imune, por meio de efeitos sobre o estado de ativação de macrófagos e redes de citocinas. Essas propriedades fazem do NRAMP1 um ponto de partida útil para estudar interações hospedeiro–patógeno, homeostase de metais em fagócitos e regulação imunometabólica.

NRAMP 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Slc11a1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NRAMP 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Slc11a1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Slc11a1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NRAMP 1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Slc11a1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NRAMP 1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NRAMP 1 em células tumorais com expressão de Slc11a1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.