NR3A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403378-ACT

GRIN3A codifica a subunidade NR3A dos receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA), uma família de receptores ionotrópicos de glutamato que regula a neurotransmissão excitatória permeável ao cálcio e a plasticidade sináptica. A incorporação de NR3A nos complexos receptores modula as propriedades do canal, influenciando a excitabilidade neuronal, a sinalização dependente de atividade e a maturação de circuitos. Por meio de efeitos sobre a transmissão glutamatérgica, NR3A contribui para vias que governam o neurodesenvolvimento, o refinamento de sinapses e a remodelação dependente da experiência. Alterações na expressão de GRIN3A ou no equilíbrio de subunidades do receptor NMDA têm sido associadas a fenótipos neuropsiquiátricos e do neurodesenvolvimento, tornando-o relevante para estudos mecanísticos de desregulação da sinalização excitatória.

NR3A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GRIN3A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NR3A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GRIN3A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GRIN3A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NR3A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GRIN3A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NR3A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NR3A em células tumorais com expressão de GRIN3A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.