Plasmide CRISPR d'Activation (h) NPC1L1: sc-401741-ACT

NPC1L1 (Niemann-Pick C1-like 1) code un transporteur membranaire de stérols à passages multiples, qui assure l’absorption intestinale et hépatique du cholestérol alimentaire et d’autres stérols lipophiles. Il se localise principalement à la membrane apicale et recycle via l’endocytose, établissant un lien entre le trafic membranaire, la détection des stérols et les voies d’homéostasie lipidique. L’activité de NPC1L1 influence la disponibilité intracellulaire du cholestérol et, en aval, la régulation des programmes métaboliques lipidiques contrôlés par les SREBP. Une absorption des stérols dépendante de NPC1L1 dérégulée est fréquemment étudiée dans le contexte de l’hypercholestérolémie, des dysfonctions métaboliques et de la biologie liée à l’athérosclérose.

NPC1L1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NPC1L1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NPC1L1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NPC1L1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NPC1L1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NPC1L1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NPC1L1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NPC1L1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NPC1L1 dans les cellules tumorales présentant une expression de NPC1L1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.