NOS2/iNOS Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400066-ACT

Il gene umano **NOS2** codifica la **nitric oxide synthase inducibile (iNOS)**, un enzima responsivo all’infiammazione che genera ossido nitrico a partire dalla L-arginina e modula la segnalazione redox, la regolazione del tono vascolare e la difesa antimicrobica. NOS2/iNOS è fortemente regolata da NF-κB e dalle vie citochiniche dipendenti da JAK/STAT e può rimodellare il metabolismo cellulare e la funzione mitocondriale attraverso stress nitrosativo e ossidativo. Un’attività di NOS2 deregolata è stata collegata a stati infiammatori cronici, alle interazioni ospite–patogeno e al rimodellamento immunitario associato ai tumori tramite effetti sulle risposte al danno del DNA, sull’angiogenesi e sulla polarizzazione delle cellule immunitarie. In quanto mediatore dipendente dal contesto della segnalazione dell’ossido nitrico, NOS2 è ampiamente studiata in macrofagi, cellule epiteliali e modelli di cancro per analizzare i circuiti infiammatori e l’adattamento allo stress.

NOS2/iNOS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NOS2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NOS2/iNOS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NOS2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NOS2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NOS2/iNOS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NOS2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NOS2/iNOS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NOS2/iNOS nelle cellule tumorali con espressione di NOS2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.