Plásmido CRISPR de Activación (h) NOPAR: sc-409016-ACT

MED12L codifica NOPAR, una proteína nuclear vinculada al control transcripcional y a la regulación génica dependiente de la ARN polimerasa II mediante mecanismos asociados al complejo Mediator. Al influir en la comunicación entre potenciadores (enhancers) y promotores y en el reclutamiento de cofactores, MED12L está en posición de modular programas de estado celular como la proliferación, la diferenciación y la transcripción sensible al estrés. La alteración de componentes del eje Mediator, incluido MED12L, se asocia de forma recurrente con redes de expresión génica desreguladas observadas en trastornos del desarrollo y en diversos cánceres, lo que respalda su relevancia para estudios mecanísticos de la desregulación transcripcional. Por ello, el análisis de MED12L/NOPAR resulta útil para cartografiar circuitos reguladores y vincular relaciones genotipo–fenotipo en modelos celulares humanos.

NOPAR El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MED12L sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

NOPAR El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MED12L en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MED12L, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de NOPAR. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MED12L y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de NOPAR en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía NOPAR en células tumorales con expresión de MED12L silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.