Nodal CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401439-ACT

Das humane Gen **NODAL** codiert das sekretierte Morphogen **Nodal**, einen Liganden der **TGF-β-Superfamilie**, der über **Activin-Rezeptoren** und **SMAD2/3** signalisiert und so die Festlegung der Keimblätter, die Achsenbildung sowie die Aufrechterhaltung entwicklungsbezogener Transkriptionsprogramme reguliert. Die Nodal-Aktivität wird streng durch Rückkopplung mit Antagonisten wie **LEFTY**-Proteinen sowie durch Cross-talk mit **WNT**- und **FGF**-Signalwegen kontrolliert, was Zellschicksalsentscheidungen und epithelial–mesenchymale Transitionen formt. Eine aberrante Reaktivierung des NODAL-Signalwegs wurde in mehreren Tumorkontexten mit veränderten Differenzierungszuständen und invasiven Phänotypen in Verbindung gebracht, was seine Nutzung als mechanistischen Knotenpunkt in Entwicklungs- und Krankheitsmodellen stützt. Als Ligand eines Signalwegs bietet Nodal einen gut untersuchbaren Readout zur Analyse parakriner Signalgebung, SMAD-abhängiger Transkription und Linienplastizität in humanen Zellsystemen.

Nodal Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NODAL-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nodal Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NODAL-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NODAL-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nodal-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NODAL-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nodal-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nodal-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NODAL-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.