NMDAε4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401683-ACT

GRIN2D codifica a subunidade humana do receptor NMDA NMDAε4 (GluN2D), um componente modulador dos receptores ionotrópicos de glutamato que controla a transmissão sináptica permeável a Ca²⁺ e a integração de sinais dependente da atividade. A incorporação de NMDAε4 influencia a cinética do canal, a sensibilidade aos agonistas e os padrões de desenvolvimento da neurotransmissão excitatória, moldando a plasticidade sináptica e a excitabilidade das redes neuronais. A sinalização do receptor NMDA envolve vias dependentes de cálcio, incluindo CaMK/CREB, MAPK/ERK e programas dependentes de calcineurina, que regulam a expressão gênica e a maturação das sinapses. A desregulação da sinalização glutamatérgica associada ao GRIN2D tem sido relacionada a fenótipos neurodesenvolvimentais e neurológicos, tornando-o um locus útil para estudos mecanísticos de estresse excitotóxico, função de circuitos e relações genótipo–fenótipo.

NMDAε4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GRIN2D sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NMDAε4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GRIN2D em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GRIN2D, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NMDAε4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GRIN2D nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NMDAε4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NMDAε4 em células tumorais com expressão de GRIN2D silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.