NG2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400699-ACT

CSPG4 codifica il proteoglicano transmembrana di condroitin solfato NG2 (noto anche come HMW-MAA), un recettore associato alla matrice pericellulare che regola adesione, migrazione e proliferazione cellulare. NG2 partecipa a reti di segnalazione collegate a integrine/FAK, PDGFR e al rimodellamento del citoscheletro, influenzando le interazioni con la matrice extracellulare e la plasticità cellulare. Nel sistema nervoso è un marcatore distintivo delle cellule precursori degli oligodendrociti e modula processi legati alla mielinizzazione, mentre in altri tessuti supporta i comportamenti delle cellule perivascolari e stromali. Un’espressione deregolata di CSPG4/NG2 è stata associata a variazioni dell’invasività e delle interazioni con il microambiente in molteplici contesti tumorali, rendendolo un bersaglio utile per studi meccanicistici sullo stato di linea e sulla segnalazione cellula–matrice.

NG2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CSPG4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NG2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CSPG4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CSPG4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NG2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CSPG4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NG2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NG2 nelle cellule tumorali con espressione di CSPG4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.