NF-H Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401267-ACT

NEFH codifica a cadeia pesada do neurofilamento humano (NF-H), uma importante subunidade de filamento intermediário que sustenta o calibre axonal, a integridade estrutural e a condução a longa distância em neurónios maduros. A NF-H participa na montagem dos neurofilamentos e nos processos de transporte axonal, e a sua extensa fosforilação regula o espaçamento entre filamentos e a dinâmica do citoesqueleto. A perturbação da homeostase dos neurofilamentos está associada a lesão neuronal e neurodegeneração, e a alteração da expressão ou a acumulação de NEFH/NF-H é frequentemente estudada em contextos de stress axonal e vulnerabilidade dos neurónios motores. Como componente central do citoesqueleto neuronal, a NF-H serve como uma leitura funcional de vias que regulam a diferenciação, a remodelação do citoesqueleto e a proteostase.

NF-H O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NEFH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NF-H O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NEFH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NEFH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NF-H. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NEFH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NF-H no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NF-H em células tumorais com expressão de NEFH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.