nephrocystin-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406788-ACT

NPHP3 codifica la nefrocistina-3, una proteina associata alle ciglia che si localizza nel ciglio primario e nella regione del centrosoma, dove contribuisce alla ciliogenesi, alla segnalazione ciliare e al mantenimento della polarità epiteliale. La nefrocistina-3 partecipa a complessi proteici nella zona di transizione del ciglio, che regolano il traffico dei recettori di segnalazione e influenzano vie come Hedgehog e Wnt, le quali dipendono da una funzione ciliare integra. L’alterazione dei processi dipendenti da NPHP3 può compromettere la segnalazione meccanosensoriale e quella dello sviluppo negli epiteli renali e in altri epiteli, collegando il suo studio ai meccanismi delle ciliopatie. Di conseguenza, NPHP3 è un bersaglio utile per indagare la trasduzione del segnale mediata dalle ciglia, la tubulogenesi e le relazioni genotipo–fenotipo in modelli cellulari umani.

nephrocystin-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NPHP3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

nephrocystin-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NPHP3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NPHP3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di nephrocystin-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NPHP3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da nephrocystin-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via nephrocystin-3 nelle cellule tumorali con espressione di NPHP3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.