N-WASP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401440-ACT

WASL codifica a N-WASP humana, uma proteína reguladora de actina multidomínio que integra a sinalização de GTPases da família Rho e de fosfoinositídeos à nucleação de actina ramificada mediada por Arp2/3. Ao coordenar a remodelação do citoesqueleto, a N-WASP sustenta processos como a endocitose mediada por clatrina, a protrusão de membrana e a migração, a dinâmica de adesão e a organização da sinapse imunológica. A atividade da N-WASP integra sinais de Cdc42, de adaptadores com domínio SH3 e de tirosina-quinases para ajustar a montagem de actina em resposta a estímulos extracelulares. A desregulação da função de WASL/N-WASP tem sido implicada em alterações da motilidade celular e do comportamento invasivo, em fenótipos do neurodesenvolvimento ligados à dinâmica de actina nas sinapses e em defeitos de sinalização em células imunes relevantes para inflamação e para interações hospedeiro–patógeno.

N-WASP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de WASL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

N-WASP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus WASL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição WASL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de N-WASP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus WASL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de N-WASP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via N-WASP em células tumorais com expressão de WASL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.