MTBP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404307-ACT

A MTBP humana (proteína ligante de MDM2) é um fator nuclear que coordena o disparo das origens de replicação do DNA e a progressão pela fase S por meio de sua interação com Treslin/TICRR e com a maquinaria de ativação da helicase CDC45–MCM–GINS. Ao acoplar o início da replicação ao controle por checkpoints, a MTBP contribui para a estabilidade do genoma e influencia programas proliferativos sob estresse replicativo. Alterações na expressão de MTBP têm sido associadas à desregulação do controle do ciclo celular e à instabilidade cromossômica, contextos frequentemente estudados na biologia tumoral e em outros distúrbios marcados por comprometimento da fidelidade da replicação do DNA. A MTBP também interage com vias que regulam o timing de replicação, respostas a danos no DNA e programas transcricionais que moldam o crescimento celular.

MTBP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MTBP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MTBP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MTBP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MTBP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MTBP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MTBP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MTBP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MTBP em células tumorais com expressão de MTBP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.