MLH3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404188-ACT

MLH3 umano codifica un omologo di MutL che funziona nella riparazione degli appaiamenti errati del DNA (mismatch repair) e nella ricombinazione meiotica, agendo insieme ad altri membri della famiglia MutL per coordinare il riconoscimento delle lesioni con le fasi successive della riparazione e con la formazione dei crossing-over. MLH3 contribuisce alla stabilità del genoma modulando gli esiti della riparazione in corrispondenza di mismatch associati alla replicazione e di intermedi della ricombinazione, influenzando il carico mutazionale e l’integrità cromosomica. Alterazioni dell’attività o dell’espressione di MLH3 sono state collegate a instabilità genomica associata al mismatch repair e sono state studiate nel contesto della suscettibilità al cancro e della biologia dell’espansione di ripetizioni. In quanto fattore di riparazione nucleare, MLH3 è comunemente oggetto di studio per i suoi ruoli nella segnalazione della risposta al danno al DNA, nella fedeltà della replicazione e nella scelta delle vie di ricombinazione.

MLH3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MLH3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MLH3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MLH3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MLH3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MLH3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MLH3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MLH3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MLH3 nelle cellule tumorali con espressione di MLH3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.