Plásmido CRISPR de Activación (h) MITF: sc-400401-ACT

El factor de transcripción asociado a microftalmia (MITF) es un factor de transcripción bHLH-LZ que determina el linaje y regula programas que controlan el desarrollo, la pigmentación, la supervivencia y la diferenciación de los melanocitos. En células humanas, MITF integra señales de vías como MAPK/ERK y cAMP/PKA para coordinar la transcripción de genes implicados en la biogénesis de los melanosomas, las respuestas al estrés oxidativo, la función lisosomal y el metabolismo celular. La actividad desregulada de MITF se ha vinculado a estados alterados de las células melanocíticas, trastornos de la pigmentación y la biología del melanoma, donde los cambios en las redes transcripcionales dependientes de MITF pueden influir en la proliferación, la invasión y la adaptación al estrés. Como nodo transcripcional central, MITF se utiliza ampliamente como herramienta molecular para estudiar la identidad celular, la plasticidad transcripcional y la regulación génica dependiente de señales.

MITF El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MITF sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

MITF El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MITF en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MITF, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de MITF. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MITF y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de MITF en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía MITF en células tumorales con expresión de MITF silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.