MDC1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405652-ACT

O Mediador do Ponto de Verificação de Danos ao DNA 1 (MDC1) é uma proteína de andaime nuclear que amplifica a sinalização de quebras de dupla fita do DNA ao se ligar à H2AX fosforilada (γH2AX) e coordenar o recrutamento de fatores de reparo e de checkpoint. Por meio de interações que sustentam a sinalização dependente de ATM, o MDC1 promove a ativação do checkpoint de dano ao DNA, a remodelação da cromatina nos locais de quebra e a escolha de via entre recombinação homóloga e junção de extremidades não homólogas. Ao estabilizar focos de dano e propagar cascatas de sinalização dependentes de ubiquitina, o MDC1 contribui para a integridade do genoma durante o estresse replicativo e após insulto genotóxico. Alterações na função ou na expressão de MDC1 têm sido associadas a fenótipos de instabilidade genômica relevantes para a biologia do câncer e para defeitos hereditários em redes de resposta a danos no DNA.

MDC1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MDC1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MDC1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MDC1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MDC1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MDC1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MDC1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MDC1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MDC1 em células tumorais com expressão de MDC1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.