MBNL2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401921-ACT

La proteina umana MBNL2 (muscleblind-like splicing regulator 2) è una proteina legante l’RNA che controlla lo splicing alternativo del pre‑mRNA, la localizzazione dell’mRNA e la stabilità dei trascritti riconoscendo motivi ricchi in YGCY negli RNA bersaglio. Contribuisce a coordinare programmi di isoforme specifici per tessuto e per stadio di sviluppo che influenzano l’organizzazione del citoscheletro, la differenziazione cellulare e l’elaborazione dell’RNA in risposta allo stress. La disregolazione dell’attività della famiglia MBNL è strettamente collegata agli anomali cambi di splicing osservati nella distrofia miotonica e in altri disordini da espansione di ripetizioni, e reti di splicing dipendenti da MBNL2 alterate sono state associate a fenotipi neuromuscolari e neurosviluppativi. Modulando i livelli di MBNL2 è quindi possibile analizzare la circuiteria dei fattori di splicing, le vie del metabolismo dell’RNA e i meccanismi specifici delle isoforme in modelli cellulari umani.

MBNL2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MBNL2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MBNL2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MBNL2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MBNL2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MBNL2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MBNL2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MBNL2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MBNL2 nelle cellule tumorali con espressione di MBNL2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.