MATH-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404019-ACT

NEUROD6 (MATH-2) è un fattore di trascrizione della famiglia basic helix–loop–helix che regola i programmi di impegno di linea neuronale, differenziamento e maturazione durante il neurosviluppo umano. Legandosi ai motivi E-box, MATH-2 coordina reti di espressione genica che controllano la crescita dei neuriti, la funzione sinaptica e la sopravvivenza neuronale, integrandosi con cascate trascrizionali dello sviluppo che modellano i circuiti corticali e ippocampali. L’attività di NEUROD6 è associata alle decisioni sul destino cellulare e a vie correlate all’eccitabilità nei neuroni, rendendolo rilevante per lo studio dei meccanismi alla base della biologia delle malattie del neurosviluppo e neuropsichiatriche. La perturbazione della trascrizione regolata da NEUROD6 può alterare identità e connettività neuronali, supportandone l’impiego per modellare reti di regolazione genica in cellule neurali umane.

MATH-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NEUROD6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MATH-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NEUROD6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NEUROD6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MATH-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NEUROD6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MATH-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MATH-2 nelle cellule tumorali con espressione di NEUROD6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.