Limkain b1 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-411308-ACT

KIAA0430は、細胞骨格の構築やアクチン関連プロセスに関与し、細胞の形態、接着、運動性を規定するヒトタンパク質Limkain b1をコードしています。Limkainファミリータンパク質に関する研究からは、膜ダイナミクスとアクチン再構築を結び付けるシグナル伝達経路との関連が示唆されており、細胞構造の協調的な変化を支えると考えられています。アクチン細胞骨格ネットワークの制御異常は、がんにおける増殖・遊走・浸潤表現型の破綻や、神経発達の文脈での神経回路形成不全としばしば関連します。Limkain b1の発現と機能を明らかにすることは、細胞骨格制御が疾患関連の細胞状態遷移に関わるより広範な転写プログラムやシグナル伝達プログラムとどのように接続しているかを解明する手がかりとなります。

Limkain b1 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性KIAA0430の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

Limkain b1 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における KIAA0430 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はKIAA0430転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性Limkain b1の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のKIAA0430遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるLimkain b1依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびKIAA0430発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるLimkain b1経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。