Plásmido CRISPR de Activación (h) Legumain: sc-402437-ACT

El LGMN humano codifica la legumaina, una endopeptidasa asparaginil lisosomal que impulsa el procesamiento proteolítico de sustratos intracelulares y extracelulares en condiciones ácidas. La legumaina participa en el recambio proteico endolisosomal, en las vías de procesamiento de antígenos en células inmunitarias y en la remodelación de la matriz extracelular mediante la activación de otras proteasas y el corte de proteínas asociadas a la matriz. La expresión y actividad desreguladas de LGMN se han asociado con inflamación, fibrosis y la biología del microambiente tumoral, donde las redes de proteasas alteradas pueden influir en la invasión, la angiogénesis y la modulación inmunitaria. Como resultado, LGMN se estudia ampliamente en la función lisosomal, la proteostasis y la señalización mediada por proteasas, relevante en contextos de cáncer y neuroinflamación.

Legumain El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de LGMN sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Legumain El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus LGMN en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional LGMN, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Legumain. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo LGMN y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Legumain en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Legumain en células tumorales con expresión de LGMN silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.