LDH-A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400403-ACT

O LDHA humano codifica a lactato desidrogenase A (LDH-A), uma enzima citosólica que catalisa a interconversão entre piruvato e lactato com reciclagem concomitante de NADH/NAD⁺, sustentando o fluxo glicolítico em condições aeróbias e hipóxicas. A LDH-A é um nó central no metabolismo da glicose e na homeostase redox, influenciando a reprogramação metabólica associada a alta demanda proliferativa e à hipóxia do microambiente. Alterações na atividade de LDHA têm sido associadas a mudanças na produção de lactato, no equilíbrio do pH intracelular e no direcionamento do carbono entre a glicólise e a oxidação mitocondrial, tornando-o relevante para estudos de regulação metabólica na biologia do câncer e em outros distúrbios com metabolismo energético desregulado.

LDH-A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LDHA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LDH-A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LDHA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LDHA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LDH-A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LDHA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LDH-A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LDH-A em células tumorais com expressão de LDHA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.