LAT1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401609-ACT

SLC7A5 codifica o transportador humano de aminoácidos do tipo L 1 (LAT1), um transportador de alta afinidade que medeia a captação de aminoácidos neutros de grande porte, como a leucina, em conjunto com a cadeia pesada SLC3A2 (CD98). Ao controlar a disponibilidade intracelular de aminoácidos, o LAT1 sustenta o sensoriamento de nutrientes e o metabolismo anabólico, influenciando redes de sinalização como o mTORC1 e vias da resposta integrada ao estresse, que acoplam o transporte ao crescimento e à proteostase. A atividade do LAT1 é frequentemente estudada em contextos de reprogramação metabólica, biologia do transporte em barreiras e fenótipos proliferativos nos quais o fluxo de aminoácidos limita a capacidade biossintética. A expressão desregulada de SLC7A5 tem sido associada a dependências nutricionais alteradas e vulnerabilidades ligadas a transportadores em múltiplos modelos de doença, tornando-o um ponto de entrada amplamente utilizado para investigar a sinalização impulsionada por aminoácidos.

LAT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC7A5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LAT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC7A5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC7A5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LAT1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC7A5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LAT1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LAT1 em células tumorais com expressão de SLC7A5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.