LASS6 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403901-ACT

CERS6 codifica a ceramida sintase 6 (LASS6), uma enzima de membrana do retículo endoplasmático que catalisa a N-acilação de esfinganina/esfingosina para gerar ceramida C16. Ao moldar os reservatórios celulares de ceramida, a LASS6 influencia o metabolismo de esfingolipídios e a sinalização a jusante ligada à organização de microdomínios de membrana, ao tráfego vesicular e a vias responsivas ao estresse. Alterações na atividade de CERS6 têm sido associadas a desregulação da homeostase lipídica e a mudanças em apoptose, autofagia e sinalização inflamatória, tornando-a relevante para estudos de disfunção metabólica e fenótipos oncogênicos. Em células humanas, a composição de ceramidas dependente de CERS6 pode modular a integridade mitocondrial e os desfechos de sinalização mediada por receptores que afetam a proliferação e decisões de destino celular.

LASS6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CERS6 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LASS6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CERS6 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CERS6, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LASS6. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CERS6 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LASS6 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LASS6 em células tumorais com expressão de CERS6 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.