KV1.5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404341-ACT

KCNA5 codifica il canale del potassio umano voltaggio-dipendente KV1.5, una subunità α correlata a Shaker che conduce la corrente rettificatrice ritardata ultrarapida e contribuisce a controllare la ripolarizzazione e l’eccitabilità di membrana. L’attività di KV1.5 modella la durata del potenziale d’azione, la frequenza di scarica e la segnalazione accoppiata al calcio, regolando il potenziale di membrana a riposo e le proprietà refrattarie in cellule eccitabili e non eccitabili. Grazie al suo contributo all’omeostasi elettrofisiologica, KCNA5 è spesso studiato in vie che collegano il flusso di ioni a programmi trascrizionali, al fabbisogno metabolico e alle risposte allo stress. Un’espressione o una funzione disregolata di KCNA5/KV1.5 è stata associata a fenotipi del ritmo cardiaco, al rimodellamento della muscolatura liscia vascolare e ad alterazioni della segnalazione proliferativa, a sostegno della sua rilevanza in modelli meccanicistici di canalopatie.

KV1.5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KCNA5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KV1.5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KCNA5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KCNA5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KV1.5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KCNA5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KV1.5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KV1.5 nelle cellule tumorali con espressione di KCNA5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.