KV1.4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405990-ACT

KCNA4 codifica o canal de potássio humano dependente de voltagem KV1.4, uma subunidade α relacionada à família Shaker que se monta em canais tetraméricos para mediar correntes de K⁺ do tipo A de inativação rápida. Ao moldar a repolarização do potencial de ação, os intervalos entre disparos e a excitabilidade sináptica, o KV1.4 contribui para o controle dependente da atividade do potencial de membrana em tecidos excitáveis. A disponibilidade do canal e sua cinética de abertura/fechamento são reguladas por fosforilação e por interações proteína–proteína que influenciam o tráfego e a estabilidade na superfície, vinculando o KCNA4 a processos de sinalização mais amplos que ajustam a excitabilidade neuronal e cardíaca. Alterações no equilíbrio das correntes da família KV1 têm sido associadas a fenótipos de sinalização elétrica desregulada relevantes para estudos de mecanismos arritmogênicos, suscetibilidade a convulsões e distúrbios de excitabilidade em sistemas modelo.

KV1.4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KCNA4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KV1.4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KCNA4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KCNA4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KV1.4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KCNA4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KV1.4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KV1.4 em células tumorais com expressão de KCNA4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.