KIR4.1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402244-ACT

KCNJ10 codifica o canal de potássio retificador de entrada KIR4.1, um determinante-chave do potencial de membrana e do tamponamento de potássio em contextos gliais e epiteliais. No sistema nervoso central, o KIR4.1 sustenta a depuração de K+ extracelular e o tamponamento espacial associados à excitabilidade neuronal, à homeostase dos astrócitos e a processos de acoplamento íon/água. A atividade do canal se integra à manutenção de gradientes eletroquímicos e influencia a sinalização a jusante por meio de alterações no potencial de repouso e na excitabilidade celular. Perturbações genéticas e funcionais de KCNJ10 têm sido associadas a fenótipos de neurodesenvolvimento e relacionados a convulsões, corroborando sua relevância em estudos de disfunção de canais iônicos e biologia glial.

KIR4.1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KCNJ10 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KIR4.1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KCNJ10 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KCNJ10, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KIR4.1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KCNJ10 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KIR4.1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KIR4.1 em células tumorais com expressão de KCNJ10 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.