Plasmide CRISPR d'Activation (h) Junctophilin-2: sc-401805-ACT

JPH2 code la junctophiline‑2, une protéine structurale d’ancrage membranaire qui stabilise les complexes de membranes jonctionnelles entre les tubules transverses/la membrane plasmique et le réticulum sarcoplasmique dans le muscle strié. En maintenant une étroite apposition de ces membranes, la junctophiline‑2 favorise un couplage excitation–contraction efficace et la libération de calcium induite par le calcium, grâce au couplage fonctionnel des canaux Ca²⁺ voltage‑dépendants et des récepteurs à la ryanodine. JPH2 intervient dans la gestion du Ca²⁺ des cardiomyocytes et du muscle squelettique, l’organisation des microdomaines membranaires et le remodelage de l’architecture jonctionnelle en réponse au stress. Des altérations de l’expression ou de la fonction de JPH2 ont été associées à une dérégulation de l’homéostasie calcique et à un remodelage structural observés dans des cardiomyopathies héréditaires et acquises, y compris dans des contextes liés à des phénotypes arythmogènes.

Junctophilin-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de JPH2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Junctophilin-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus JPH2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription JPH2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Junctophilin-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus JPH2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Junctophilin-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Junctophilin-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de JPH2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.