INSIG-2 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-402255-ACT

INSIG2は、小胞体（ER）膜タンパク質であるINSIG-2をコードしており、ステロールが十分に存在する条件下でSCAP–SREBP複合体をER内に保持させることで、ステロール調節エレメント結合タンパク質（SREBP）の活性化を抑制します。このステロール感知チェックポイントを介して、INSIG-2は細胞内の脂質利用可能性に応じてコレステロールおよび脂肪酸の生合成を協調的に制御し、代謝酵素を調節するER関連ユビキチン化経路とも連動します。INSIG2の発現や機能の変化は、脂質新生やコレステロール恒常性の破綻と関連づけられており、インスリン抵抗性、肥満関連形質、肝臓での脂質蓄積などを含む代謝表現型との関連が報告されています。経路上の結節点として、INSIG-2は脂質代謝の転写制御、ERストレスと代謝のクロストーク、ならびにSREBP標的遺伝子のフィードバック制御を解析するために広く利用されています。

INSIG-2 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性INSIG2の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

INSIG-2 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における INSIG2 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はINSIG2転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性INSIG-2の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のINSIG2遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるINSIG-2依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびINSIG2発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるINSIG-2経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。