hnRNP I Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401435-ACT

PTBP1 codifica a proteína humana de ligação a RNA hnRNP I, um regulador multifuncional da expressão gênica pós-transcricional que se liga a motivos ricos em polipirimidinas para controlar o splicing alternativo, a estabilidade do mRNA e a tradução. A hnRNP I coordena a escolha de sítios de splicing em conjunto com componentes centrais do spliceossomo e modula programas de processamento de RNA que moldam transições de estado celular, incluindo a diferenciação neuronal e a expressão gênica responsiva ao estresse. Por meio de sua influência na inclusão de éxons, no acoplamento à degradação mediada por nonsense (NMD) e na tradução dependente de sítios internos de entrada do ribossomo (IRES), PTBP1 impacta vias envolvidas em metabolismo, controle do ciclo celular e vigilância de RNA. A atividade desregulada de PTBP1 e o redirecionamento do splicing têm sido associados à biologia do câncer e a alterações do transcriptoma ligadas ao neurodesenvolvimento ou à neurodegeneração, tornando-o um nó útil para estudos mecanísticos do processamento de RNA.

hnRNP I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PTBP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

hnRNP I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PTBP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PTBP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de hnRNP I. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PTBP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de hnRNP I no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via hnRNP I em células tumorais com expressão de PTBP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.