hippocalcin Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420938-ACT

Hpca codifica a hipocalcina, uma proteína de ligação ao cálcio do tipo EF-hand, enriquecida em neurônios, que atua como um sensor de cálcio ligando transientes de Ca2+ dependentes da atividade a sinalização a jusante. A hipocalcina participa de mecanismos de plasticidade sináptica ao modular interações proteicas reguladas por Ca2+, a associação à membrana por meio da comutação de miristoil (myristoyl switching) e processos relacionados à endocitose que moldam a neurotransmissão. Em circuitos cerebrais de camundongos, a expressão de Hpca está associada à regulação da excitabilidade neuronal e a mudanças sinápticas de longo prazo, conectando-a a vias que influenciam aprendizagem e memória. Alterações na homeostase do cálcio e na sinalização sináptica implicam redes relacionadas à hipocalcina em fenótipos de neurodegeneração e de doenças neuropsiquiátricas utilizados em modelos de pesquisa mecanística.

hippocalcin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Hpca sem alterar a sequência de ADN subjacente.

hippocalcin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Hpca em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Hpca, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de hippocalcin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Hpca nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de hippocalcin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via hippocalcin em células tumorais com expressão de Hpca silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.