HIP12 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405552-ACT

O HIP1R humano codifica a huntingtin interacting protein 1 related (HIP12), um adaptador endocítico que conecta poços revestidos por clatrina ao citoesqueleto de actina e participa da internalização de receptores e do tráfego de membranas. A HIP12 contém domínios que se ligam à clatrina e à F-actina, dando suporte à formação de vesículas, à triagem de carga e à coordenação da dinâmica do citoesqueleto. Por meio dessas funções, a HIP12 contribui para vias que regulam a endocitose, a atenuação da sinalização celular e eventos de remodelamento dependentes do citoesqueleto. A regulação alterada de adaptadores endocíticos como o HIP1R tem sido associada na literatura a perturbações em redes de sinalização e na homeostase celular relevantes para a neurobiologia e fenótipos relacionados ao câncer, tornando a HIP12 um alvo útil para estudos mecanísticos.

HIP12 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HIP1R sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HIP12 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HIP1R em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HIP1R, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HIP12. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HIP1R nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HIP12 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HIP12 em células tumorais com expressão de HIP1R silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.