Herc2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405015-ACT

HERC2 codifica a ligase E3 ubiquitina-proteína humana Herc2, uma grande ligase de ubiquitina com domínio HECT que coordena a proteostase e a sinalização dependentes de ubiquitina. A Herc2 participa de redes de resposta a danos no DNA e de processos associados à cromatina, ajudando a modular a renovação (turnover) e a localização de reguladores-chave envolvidos na estabilidade do genoma, na progressão do ciclo celular e na sinalização de estresse. Por meio da ubiquitinação e de funções do tipo “scaffold” (andaime), a HERC2 influencia vias ligadas ao estresse de replicação e ao reparo, e alterações na atividade da HERC2 têm sido associadas a fenótipos neurodoenvolvimentais hereditários e a defeitos de manutenção do genoma relevantes para o câncer. Essas propriedades fazem da HERC2 um alvo útil para estudar a regulação da via da ubiquitina, a comunicação cruzada entre vias de reparo de DNA e as relações genótipo–fenótipo em modelos celulares humanos.

Herc2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HERC2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Herc2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HERC2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HERC2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Herc2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HERC2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Herc2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Herc2 em células tumorais com expressão de HERC2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.