HCN4 Plásmido CRISPR/Cas9 KO (h): sc-402293

Descripción general

HCN4 codifica el canal 4 activado por hiperpolarización y regulado por nucleótidos cíclicos (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated), un canal marcapasos tetramérico que conduce la corriente “funny” (If) para controlar la despolarización diastólica y la excitabilidad rítmica. La compuerta del canal se activa por la hiperpolarización de la membrana y se modula mediante nucleótidos cíclicos, lo que vincula la función de HCN4 con la señalización dependiente de AMPc y la regulación autonómica del potencial de membrana. La actividad de HCN4 determina el automatismo del nodo sinoauricular y aspectos más amplios de la fisiología de conducción cardíaca, y la alteración de su función se asocia con trastornos del ritmo tanto hereditarios como adquiridos. En sistemas celulares, HCN4 ofrece una lectura manejable para estudiar mecanismos que gobiernan la biogénesis de canales iónicos, su tráfico y los fenotipos electrofisiológicos.

El plásmido CRISPR/Cas9 KO HCN4 (h) es un conjunto de plásmidos diseñado para la interrupción selectiva del gen HCN4 en líneas celulares human. Cada plásmido del conjunto coexpresa un ARN guía específico (sgRNA) único, dirigido a un sitio distinto dentro del locus HCN4, junto con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes, y codifica GFP para permitir la identificación fluorescente y el enriquecimiento de las células transfectadas con éxito. Esta estrategia multiguía aumenta la probabilidad de inducir desplazamientos de marco de lectura o deleciones que produzcan una inactivación funcional, ofreciendo una alternativa más robusta a los enfoques de guía única. Las DSB inducidas en múltiples sitios se resuelven mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o, cuando se utiliza con la plantilla donante HDR incluida, mediante reparación dirigida por homología (HDR) en un sitio diana definido dentro del locus.

Cuando se utiliza junto con el donante HDR que expresa RFP, la fluorescencia de GFP y RFP puede utilizarse conjuntamente para distinguir las poblaciones de células transfectadas de las editadas, lo que agiliza los flujos de trabajo de clasificación y selección de clones basados en citometría de flujo.

Donante de reparación dirigida por homología (HDR) — Casete de puromicina con reportero RFP

Para aplicaciones que requieren clones knockout confirmados y seleccionables, el plásmido HDR HCN4 (h) incluye un constructo donante HDR que contiene un casete de resistencia a la puromicina (PuroR) y un reportero de proteína fluorescente roja (RFP), flanqueado por brazos de homología específicos de un sitio diana definido HCN4.
Cuando se cotransfecciona con el plásmido HCN4 CRISPR/Cas9 KO (h):

• El casete PuroR-RFP se integra en el sitio de corte de Cas9 mediante HDR, interrumpiendo el marco de lectura abierto HCN4.
  La fluorescencia de la RFP proporciona un indicador visual inmediato del éxito de la integración, lo que permite la identificación o clasificación basada en la fluorescencia de las células editadas antes o junto con la selección con puromicina.
  Las células editadas con éxito se confirman mediante la resistencia a la puromicina, lo que reduce sustancialmente la carga de cribado de clones.
  Esta estrategia de selección es ideal para generar líneas celulares KO clonales estables para estudios funcionales posteriores, cribado de fármacos o desarrollo de modelos.

Sistema de eliminación del casete Cre-lox

La construcción donante HDR cuenta con sitios loxP que flanquean el casete de selección PuroR-RFP para permitir la eliminación limpia del marcador tras la confirmación del clon. La expresión transitoria de la recombinasa Cre a través del vector Cre: sc-418923 incluido extirpa el casete, dejando un sitio loxP residual mínimo dentro del locus HCN4 y eliminando posibles efectos de confusión en los ensayos posteriores.
Este enfoque en dos pasos:

• Minimiza la alteración de la arquitectura local de la cromatina y de los elementos reguladores vecinos
  Restaura un contexto genómico casi nativo en el locus editado
  Permite reutilizar la estrategia de selección con puromicina en la misma línea celular para ediciones adicionales

Características principales

• gRNA dirigido a los exones HCN4 críticos para la función HCN4
  Coexpresión de SpCas9 y sgRNA a partir de un único plásmido para una administración simplificada
  Donante HDR con resistencia a la puromicina para la selección positiva de clones
  Casete PuroR flanqueado por loxP con vector de recombinasa Cre para la eliminación sin fisuras del marcador
  Se suministra listo para su uso mediante transfección

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.