HCN4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402293-ACT

HCN4 codifica o canal 4 ativado por hiperpolarização e regulado por nucleotídeos cíclicos (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated), um mediador principal da corrente “funny” (If), que contribui para a despolarização diastólica espontânea e para a atividade elétrica rítmica. O canal conduz correntes de entrada mistas de Na⁺/K⁺ ativadas por hiperpolarização e é modulado diretamente por cAMP, conectando a sinalização autonômica à excitabilidade da membrana. O HCN4 atua na interseção entre a regulação do marcapasso, a dinâmica de repolarização da membrana e vias de sinalização dependentes de cAMP que moldam o disparo de potenciais de ação. Alterações na expressão ou na função de HCN4 têm sido associadas a fenótipos de condução cardíaca e à regulação do ritmo, tornando-o relevante para estudos mecanísticos de eletrofisiologia e excitabilidade em modelos celulares humanos.

HCN4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HCN4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HCN4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HCN4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HCN4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HCN4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HCN4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HCN4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HCN4 em células tumorais com expressão de HCN4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.