GRP94 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-423491-ACT

O gene Hsp90b1 de camundongo codifica a GRP94 (gp96), uma chaperona da família HSP90 residente no retículo endoplasmático, que dá suporte ao dobramento de proteínas, ao controle de qualidade e à homeostase do RE. A GRP94 é essencial para a maturação e o tráfego de determinadas proteínas secretórias e de membrana, incluindo integrinas e receptores do tipo Toll, influenciando assim a adesão celular, a sinalização imune inata e vias mediadas por receptores. Sua atividade está intimamente acoplada à sinalização de estresse do RE e à resposta a proteínas mal dobradas (UPR), ligando a regulação de Hsp90b1 à proteostase, à inflamação e à adaptação celular ao estresse. A desregulação da função da GRP94 tem sido associada a fenótipos imunológicos alterados, a perturbações na biologia da via secretória e a respostas ao estresse relevantes para doenças em modelos de câncer e disfunção metabólica.

GRP94 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Hsp90b1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GRP94 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Hsp90b1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Hsp90b1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GRP94. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Hsp90b1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GRP94 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GRP94 em células tumorais com expressão de Hsp90b1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.