GRHL2 Plásmido CRISPR/Cas9 KO (m): sc-434250

Descripción general

Grhl2 codifica la proteína tipo grainyhead 2 (GRHL2), un factor de transcripción que coordina la diferenciación epitelial y el mantenimiento de la función de barrera al regular genes implicados en la adhesión célula–célula, la organización de las uniones y los programas de queratinización. En tejidos de ratón, GRHL2 sostiene la polaridad y la homeostasis epiteliales y se integra con redes de señalización que determinan la morfogénesis y la especificación de linajes, incluidas vías asociadas con la identidad epitelial y las respuestas al estrés. La alteración de la actividad de GRHL2 se ha asociado con una plasticidad epitelial desregulada y con cambios en programas transcripcionales relevantes para anomalías del desarrollo y la remodelación, asociada a enfermedad, de los estados epiteliales. Estas propiedades hacen de Grhl2 un nodo útil para estudiar el control transcripcional de la arquitectura epitelial, el desarrollo tisular y el cambio de fenotipo.

El plásmido CRISPR/Cas9 KO GRHL2 (m) es un conjunto de plásmidos diseñado para la interrupción selectiva del gen Grhl2 en líneas celulares mouse. Cada plásmido del conjunto coexpresa un ARN guía específico (sgRNA) único, dirigido a un sitio distinto dentro del locus Grhl2, junto con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes, y codifica GFP para permitir la identificación fluorescente y el enriquecimiento de las células transfectadas con éxito. Esta estrategia multiguía aumenta la probabilidad de inducir desplazamientos de marco de lectura o deleciones que produzcan una inactivación funcional, ofreciendo una alternativa más robusta a los enfoques de guía única. Las DSB inducidas en múltiples sitios se resuelven mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o, cuando se utiliza con la plantilla donante HDR incluida, mediante reparación dirigida por homología (HDR) en un sitio diana definido dentro del locus.

Cuando se utiliza junto con el donante HDR que expresa RFP, la fluorescencia de GFP y RFP puede utilizarse conjuntamente para distinguir las poblaciones de células transfectadas de las editadas, lo que agiliza los flujos de trabajo de clasificación y selección de clones basados en citometría de flujo.

Donante de reparación dirigida por homología (HDR) — Casete de puromicina con reportero RFP

Para aplicaciones que requieren clones knockout confirmados y seleccionables, el plásmido HDR GRHL2 (m) incluye un constructo donante HDR que contiene un casete de resistencia a la puromicina (PuroR) y un reportero de proteína fluorescente roja (RFP), flanqueado por brazos de homología específicos de un sitio diana definido Grhl2.
Cuando se cotransfecciona con el plásmido GRHL2 CRISPR/Cas9 KO (m):

• El casete PuroR-RFP se integra en el sitio de corte de Cas9 mediante HDR, interrumpiendo el marco de lectura abierto Grhl2.
  La fluorescencia de la RFP proporciona un indicador visual inmediato del éxito de la integración, lo que permite la identificación o clasificación basada en la fluorescencia de las células editadas antes o junto con la selección con puromicina.
  Las células editadas con éxito se confirman mediante la resistencia a la puromicina, lo que reduce sustancialmente la carga de cribado de clones.
  Esta estrategia de selección es ideal para generar líneas celulares KO clonales estables para estudios funcionales posteriores, cribado de fármacos o desarrollo de modelos.

Sistema de eliminación del casete Cre-lox

La construcción donante HDR cuenta con sitios loxP que flanquean el casete de selección PuroR-RFP para permitir la eliminación limpia del marcador tras la confirmación del clon. La expresión transitoria de la recombinasa Cre a través del vector Cre: sc-418923 incluido extirpa el casete, dejando un sitio loxP residual mínimo dentro del locus Grhl2 y eliminando posibles efectos de confusión en los ensayos posteriores.
Este enfoque en dos pasos:

• Minimiza la alteración de la arquitectura local de la cromatina y de los elementos reguladores vecinos
  Restaura un contexto genómico casi nativo en el locus editado
  Permite reutilizar la estrategia de selección con puromicina en la misma línea celular para ediciones adicionales

Características principales

• gRNA dirigido a los exones Grhl2 críticos para la función GRHL2
  Coexpresión de SpCas9 y sgRNA a partir de un único plásmido para una administración simplificada
  Donante HDR con resistencia a la puromicina para la selección positiva de clones
  Casete PuroR flanqueado por loxP con vector de recombinasa Cre para la eliminación sin fisuras del marcador
  Se suministra listo para su uso mediante transfección

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.