GRASP65 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402436-ACT

Il gene umano **GORASP1** codifica **GRASP65**, una proteina periferica di membrana che si localizza nel cis-Golgi e funge da organizzatore chiave dell’architettura del nastro golgiano. GRASP65 contribuisce all’impilamento delle cisterne del Golgi, all’ancoraggio delle vescicole e alla riassemblaggio delle membrane del Golgi durante l’ingresso e l’uscita dalla mitosi, integrandosi con il traffico dal reticolo endoplasmatico (RE) al Golgi e con un controllo più ampio della via secretoria. Attraverso i suoi ruoli nell’organizzazione degli organelli e nella processazione del carico, GRASP65 influenza lo smistamento proteico, la glicosilazione e il trasporto polarizzato, processi centrali per la progressione del ciclo cellulare e per le risposte allo stress. La disregolazione della struttura del Golgi e delle vie di traffico che coinvolgono GRASP65 è rilevante per fenotipi associati a malattia nella biologia del cancro e nella neurodegenerazione, dove sono comunemente osservate alterazioni della secrezione e del rimodellamento degli organelli.

GRASP65 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GORASP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GRASP65 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GORASP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GORASP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GRASP65. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GORASP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GRASP65 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GRASP65 nelle cellule tumorali con espressione di GORASP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.