GPR116 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-408424-ACT

ADGRF5 (GPR116) é um receptor acoplado à proteína G do tipo adesão, com um grande N-terminal extracelular e um sítio de proteólise de GPCR que conecta a matriz extracelular e as interações célula–célula à sinalização intracelular. Ele é expresso em compartimentos epiteliais e endoteliais, incluindo o pulmão, onde contribui para a homeostase tecidual e para processos relacionados à barreira por meio de vias mediadas por GPCR, como a sinalização cAMP/PKA e de GTPases Rho. O GPR116 tem sido implicado na regulação do equilíbrio do surfactante e da função alveolar, e alterações na expressão foram associadas a remodelamento inflamatório e respostas fibróticas em tecidos respiratórios. A desregulação de ADGRF5 também foi relatada em diversos conjuntos de dados transcriptômicos de câncer, apoiando seu uso em estudos de interações tumor–microambiente, sinalização de adesão e migração celular.

GPR116 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ADGRF5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GPR116 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ADGRF5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ADGRF5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GPR116. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ADGRF5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GPR116 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GPR116 em células tumorais com expressão de ADGRF5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.