GPR110 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405326-ACT

ADGRF1 codifica per il recettore di adesione accoppiato a proteina G GPR110, un recettore di membrana multipasso implicato nella regolazione delle interazioni cellula–cellula e nell’integrazione dei segnali extracellulari a livello della membrana plasmatica. In quanto aGPCR, GPR110 può accoppiarsi a proteine G eterotrimeriche per modulare la segnalazione dei secondi messaggeri e i programmi a valle che controllano proliferazione, sopravvivenza e differenziamento, con effetti dipendenti dal contesto nei diversi tipi di tessuto. Un’espressione alterata di ADGRF1 è stata riportata in studi di biologia tumorale e di processi dello sviluppo, rendendolo un bersaglio utile per analizzare la plasticità trascrizionale e fenotipica guidata dai GPCR. La mappatura delle reti di segnalazione dipendenti da ADGRF1 può supportare ricerche meccanicistiche su migrazione cellulare, stati simil-staminali e capacità di risposta al microambiente.

GPR110 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ADGRF1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPR110 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ADGRF1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ADGRF1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPR110. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ADGRF1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPR110 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPR110 nelle cellule tumorali con espressione di ADGRF1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.