GPD1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403706-ACT

Das humane GPD1 kodiert die zytosolische Glycerol-3-phosphat-Dehydrogenase 1, ein NADH-abhängiges Enzym, das Dihydroxyacetonphosphat und Glycerol-3-phosphat ineinander umwandelt und so den Kohlenhydratstoffwechsel mit der Lipidbiosynthese koppelt. Diese Aktivität unterstützt den Glycerol-3-phosphat-Shuttle, trägt zur Redox-Homöostase bei und stellt Glycerol-3-phosphat für die Bildung von Triglyceriden und Phospholipiden bereit. Durch seine Rolle an der Schnittstelle von Glykolyse, Glycerolipidstoffwechsel und zellulärem NADH/NAD+-Gleichgewicht hilft GPD1, den metabolischen Fluss unter Nährstoffmangel und hypoxischem Stress zu prägen. In der Literatur wurden fehlregulierte, mit GPD1 assoziierte Signal- und Stoffwechselwege mit metabolischen Phänotypen in Verbindung gebracht, die das hepatische Lipidhandling und die allgemeine Energiehomöostase betreffen, was GPD1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien der metabolischen Regulation macht.

GPD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GPD1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GPD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GPD1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GPD1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GPD1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GPD1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GPD1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GPD1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GPD1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.