gp91phox Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-419890-ACT

Cybb codifica a gp91phox (NOX2), a subunidade catalítica de membrana do complexo NADPH oxidase dos fagócitos, responsável por impulsionar a geração de espécies reativas de oxigênio durante a explosão respiratória. Em células da imunidade inata de camundongo, a gp91phox se associa à p22phox e a reguladores citosólicos como p47phox, p67phox e Rac para montar um sistema de transporte de elétrons que reduz o oxigênio a superóxido, contribuindo para a eliminação de microrganismos e para a sinalização dependente de estado redox. Essa atividade influencia vias inflamatórias, a função fagolisossomal e as respostas ao estresse oxidativo. A interrupção ou desregulação de Cybb/NOX2 é amplamente estudada em modelos de imunodeficiência, inflamação crônica e lesão tecidual associada ao redox.

gp91phox O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Cybb sem alterar a sequência de ADN subjacente.

gp91phox O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Cybb em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Cybb, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de gp91phox. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Cybb nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de gp91phox no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via gp91phox em células tumorais com expressão de Cybb silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.