girdin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402236-ACT

O CCDC88A humano codifica a girdina, uma grande proteína “scaffold” ligadora de actina que integra a sinalização de fatores de crescimento e de GPCRs com a remodelação do citoesqueleto para coordenar a polaridade celular, a migração direcionada e a adesão. A girdina atua a jusante de PI3K–AKT e interage com proteínas G heterotriméricas e reguladores de polaridade para influenciar a formação de lamelipódios, o tráfego vesicular e a dinâmica de sinalização de receptores. Por meio dessas funções, o CCDC88A contribui para processos como o crescimento de neuritos e a organização epitelial, e alterações na expressão ou no acoplamento de sinalização têm sido associadas a fenótipos anômalos de motilidade e sobrevivência observados no câncer e em outros contextos de doenças proliferativas ou do neurodesenvolvimento. Sua conectividade em vias de sinalização torna o CCDC88A um nó útil para dissecar como a arquitetura do citoesqueleto modula a transdução de sinais e transições de estado celular.

girdin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CCDC88A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

girdin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CCDC88A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CCDC88A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de girdin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CCDC88A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de girdin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via girdin em células tumorais com expressão de CCDC88A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.