GFRα-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405061-ACT

GFRA3 codifica o receptor humano GFRα-3, ancorado à membrana por glicosilfosfatidilinositol (GPI), que atua como co-receptor ao se ligar a membros da família de ligantes do fator neurotrófico derivado da linhagem de células gliais (GDNF) e acoplar a sinalização ao receptor tirosina-quinase RET. Por meio da ativação dependente de RET das vias MAPK/ERK, PI3K/AKT e de outras vias relacionadas à sobrevivência e diferenciação, o GFRα-3 contribui para o desenvolvimento neuronal, a orientação axonal e a manutenção de neurônios sensoriais periféricos e autonômicos. A expressão e a sinalização de GFRA3 têm sido investigadas em contextos de regulação do neurodesenvolvimento, biologia de neurônios sensoriais relacionada à dor e modulação de vias oncogênicas em modelos tumorais específicos nos quais a atividade do eixo RET está implicada. Como componente de um receptor de superfície celular, também é útil para estudar a especificidade ligante–receptor, a montagem de complexos receptoriais e as respostas transcricionais a jusante.

GFRα-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GFRA3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GFRα-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GFRA3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GFRA3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GFRα-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GFRA3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GFRα-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GFRα-3 em células tumorais com expressão de GFRA3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.