GALT Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405717-ACT

A GALT humana (galactose-1-fosfato uridililtransferase) é uma enzima citosólica da via de Leloir que catalisa a conversão de galactose-1-fosfato e UDP-glicose em glicose-1-fosfato e UDP-galactose, sustentando a utilização celular de carboidratos e a homeostase de UDP-açúcares. Ao manter equilíbrios adequados de metabólitos de galactose e de açúcares nucleotídicos, a GALT influencia a capacidade de glicosilação e a estabilidade de redes metabólicas mais amplas. A disfunção da atividade de GALT está classicamente associada a fenótipos de galactosemia e oferece um modelo bem definido para investigar respostas ao estresse metabólico e efeitos subsequentes na biossíntese de macromoléculas. Em sistemas experimentais, a modulação da expressão de GALT é usada para examinar o processamento da galactose, vias de glicosilação dependentes de UDP-açúcares e vulnerabilidades metabólicas sob condições nutricionais definidas.

GALT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GALT sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GALT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GALT em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GALT, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GALT. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GALT nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GALT no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GALT em células tumorais com expressão de GALT silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.