GalNAc-T3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407682-ACT

GALNT3 codifica a polipeptídeo N-acetilgalactosaminiltransferase 3 (GalNAc-T3), uma enzima iniciadora residente no Golgi da glicosilação O-ligada do tipo mucina, que transfere GalNAc para resíduos de serina/treonina em proteínas secretadas e de membrana. Ao definir os sítios de iniciação de O-glicanos, a GalNAc-T3 influencia o dobramento e o tráfego de proteínas, a suscetibilidade a proteases e a função de receptores/moléculas de adesão em vias epiteliais e secretoras. Alterações na atividade de GALNT3 têm sido associadas a um processamento desregulado de glicoproteínas e à sinalização extracelular, com relevância para distúrbios da homeostase do fosfato e para fenótipos mais amplos relacionados à glicosilação. Assim, a modulação de GalNAc-T3 é útil para dissecar como a O-glicosilação controla interações célula–célula, programas secretórios e a comunicação ligante–receptor.

GalNAc-T3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GALNT3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GalNAc-T3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GALNT3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GALNT3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GalNAc-T3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GALNT3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GalNAc-T3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GalNAc-T3 em células tumorais com expressão de GALNT3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.