Plasmide CRISPR d'Activation (h) GADD 34: sc-400595-ACT

PPP1R15A code pour GADD34, une sous-unité régulatrice de la protéine phosphatase 1 qui favorise la déphosphorylation de l’eIF2α afin de mettre fin à la réponse intégrée au stress et de rétablir la synthèse protéique globale après un stress cellulaire. Induit en aval de la signalisation ATF4/CHOP, GADD34 agit comme un nœud de rétrocontrôle majeur au sein des voies du stress du réticulum endoplasmique (RE) et de la réponse aux protéines mal repliées (UPR), modulant la protéostasie, la sensibilité à l’apoptose et la récupération après un arrêt de la traduction. Par son influence sur les signaux d’adaptation au stress, PPP1R15A est étudié dans des contextes tels que l’inflammation, le stress métabolique, la neurodégénérescence et la survie des cellules tumorales, où une réponse au stress dérégulée peut contribuer à des phénotypes pathologiques. Son activité recoupe également des programmes associés au stress oxydatif et aux dommages de l’ADN, ce qui en fait une cible utile pour l’étude mécanistique des réseaux de signalisation du stress.

GADD 34 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPP1R15A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GADD 34 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPP1R15A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPP1R15A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GADD 34. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPP1R15A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GADD 34 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GADD 34 dans les cellules tumorales présentant une expression de PPP1R15A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.