Fumarylacetoacetase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402478-ACT

FAH codifica la fumari-lacetoacetasi umana, un enzima citosolico che catalizza la fase terminale del catabolismo della tirosina idrolizzando il fumari-lacetoacetato in fumarato e acetoacetato. Questa reazione collega la degradazione degli amminoacidi aromatici al metabolismo centrale del carbonio attraverso la produzione di precursori del ciclo del TCA e dei corpi chetonici, e contribuisce a prevenire l’accumulo di intermedi reattivi in grado di modificare le macromolecole cellulari. L’alterazione dell’attività di FAH è associata alla tirosinemia ereditaria di tipo I ed è ampiamente utilizzata come modello di stress metabolico degli epatociti, risposte al danno del DNA e sistemi di selezione epato-selettivi in contesti sperimentali. Di conseguenza, FAH rappresenta un nodo chiave per lo studio del flusso nelle vie metaboliche, della capacità di detossificazione e dell’omeostasi degli epatociti.

Fumarylacetoacetase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FAH senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Fumarylacetoacetase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FAH nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FAH, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Fumarylacetoacetase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FAH nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Fumarylacetoacetase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Fumarylacetoacetase nelle cellule tumorali con espressione di FAH silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.