Plásmido CRISPR de Activación (h) frizzled-1: sc-401365-ACT

FZD1 codifica frizzled-1, un receptor de WNT de siete dominios transmembrana que acopla ligandos WNT extracelulares con cascadas de señalización intracelular que controlan la especificación del destino celular, la polaridad y la proliferación. Tras la unión del ligando, frizzled-1 puede activar programas transcripcionales canónicos dependientes de β-catenina/TCF e interactuar con las vías no canónicas de polaridad celular planar y WNT/Ca²⁺, influyendo en la dinámica del citoesqueleto y la migración. La desregulación de la señalización de FZD1 se ha vinculado con una actividad aberrante de la red WNT observada en la transformación oncogénica, la fibrosis y trastornos del desarrollo. Como receptor de superficie celular, frizzled-1 también es útil para estudiar la selectividad ligando–receptor, la comunicación cruzada entre vías y el tráfico del receptor en sistemas modelo humanos.

frizzled-1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de FZD1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

frizzled-1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus FZD1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional FZD1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de frizzled-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo FZD1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de frizzled-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía frizzled-1 en células tumorales con expresión de FZD1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.