FOXD2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410785-ACT

FOXD2 codifica un fattore di trascrizione della famiglia forkhead box (FOX) che si lega a motivi del DNA sequenza-specifici per regolare programmi di espressione genica coinvolti nell’identità cellulare e nel patterning dello sviluppo. In qualità di regolatore nucleare, FOXD2 contribuisce alle reti trascrizionali che controllano la specificazione di linea, la differenziazione e la morfogenesi tissutale attraverso una modulazione coordinata dei geni bersaglio a valle. Una regolazione trascrizionale disfunzionale dei fattori della famiglia FOX è spesso associata a proliferazione aberrante e a stati di differenziazione alterati, rendendo FOXD2 rilevante per lo studio dei disturbi dello sviluppo e dei circuiti di regolazione genica associati al cancro. FOXD2 umano è quindi utile per indagare come il dosaggio dei fattori di trascrizione rimodelli gli output trascrizionali dipendenti dalla cromatina in sistemi modello.

FOXD2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FOXD2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FOXD2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FOXD2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FOXD2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FOXD2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FOXD2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FOXD2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FOXD2 nelle cellule tumorali con espressione di FOXD2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.