Plasmide CRISPR d'Activation (h) FIH-1: sc-402511-ACT

HIF1AN code le facteur inhibant HIF‑1 (FIH‑1), une hydroxylase asparaginyle dépendante du Fe(II) et du 2‑oxoglutarate, qui atténue la transcription induite par l’hypoxie en hydroxylant HIF‑1α et en limitant le recrutement de coactivateurs (CBP/p300). Par ce point de contrôle post‑traductionnel, FIH‑1 intègre la détection de l’oxygène à la reprogrammation métabolique, à la signalisation angiogénique et à l’homéostasie redox au sein de la voie HIF. FIH‑1 modifie également des protéines contenant des répétitions ankyrine, reliant la disponibilité en oxygène à des réseaux transcriptionnels et de signalisation plus larges. Une signalisation HIF dérégulée et une activité modifiée de HIF1AN ont été associées à des phénotypes induits par l’hypoxie, pertinents pour la biologie des cancers, l’ischémie, l’inflammation et les mécanismes des maladies métaboliques.

FIH-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HIF1AN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FIH-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HIF1AN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HIF1AN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FIH-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HIF1AN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FIH-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FIH-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de HIF1AN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.