Fibulin-3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401978-ACT

EFEMP1 kodiert Fibulin-3, ein sezerniertes extrazelluläres Matrix-Glykoprotein, das mit elastischen Fasern und Komponenten der Basalmembran assoziiert und dadurch die Matrixorganisation, die Zell–Matrix-Adhäsion sowie den Gewebeumbau reguliert. Fibulin-3 beeinflusst Signalnetzwerke, die mit der Homöostase der extrazellulären Matrix verknüpft sind, darunter die Modulation der Proteaseaktivität und Wechselwirkungen mit Signalwegen wie TGF-β und VEGF, die Angiogenese, Fibrose und Stressantworten prägen. Eine veränderte EFEMP1-Expression wurde in Zusammenhängen berichtet, die die retinale Integrität und Makuladegeneration ebenso betreffen wie tumorgebundenes stromales Remodeling, was die Relevanz für Studien zur Regulation des Mikromilieus unterstreicht. Diese Eigenschaften machen EFEMP1 zu einem nützlichen Ziel für die Untersuchung der Dynamik der extrazellulären Matrix, epithelial–mesenchymaler Interaktionen und der sekretionsassoziierten Proteostase.

Fibulin-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EFEMP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Fibulin-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EFEMP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EFEMP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Fibulin-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EFEMP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Fibulin-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Fibulin-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EFEMP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.